Atividade da óxido nítrico sintase em plaquetas humanas: um método otimizado

Resumo

A análise cinética da atividade da óxido nítrico sintase (NOS) plaquetária foi avaliada pela conversão de [³H]-arginina em [³H]-citrulina em plaquetas humanas frescas não estimuladas. A atividade da NOS foi detectada na fração citosólica e na membrana, além de ser dependente de Ca2+-calmodulina, que é uma característica da NOS endotelial (eNOS). A omissão de NADPH levou à diminuição da atividade da NOS dependente da dose causando redução de 85,2% da atividade enzimática. A cinética variou de acordo com as concentrações de proteína e de arginina, sendo que as melhores leituras foram obtidas com 80 µg de proteína, 120 nM de arginina em 0,5 µCi de ³H arginina, em 60 minutos de incubação. A atividade da NOS na ausência de FAD (flavina adenina dinucleotídeo), FMN (flavina mononucleotídeo) e BH4 (tetrahidrobiopterina) foi de apenas 2,8% da atividade medida na presença destes três cofatores. A atividade da enzima foi completamente inibida pelo L-NAME (1 mM; 98,1 %), EGTA (5 mM; 98,8 %) e adição de trifluoperazina (TFP), nas concentrações de 200 µM e 500 µM, inibiu a atividade da enzima em 73,2% e 83,8 %, respectivamente. Em condições basais, o Km da NOS para Larginina foi de 0,84 ± 0,08 µM e o valor de Vmax foi de 0,122 ± 0,025 pmol.mg-1.min-1. A atividade média da NOS plaquetária humana foi de 0,020 ± 0,010 pmol.mg-1.min-1. Os resultados indicam que a eNOS em plaquetas humanas pode ser avaliada pelo método da conversão de [³H]-arginina em [³H]-citrulina, que em condições otimizadas, fornece resultados reprodutíveis e precisos com ótima sensibilidade para experimentos clínicos envolvendo doenças neurológicas e psiquiátricas.