Otimização de uma qPCR baseada em curva de dissociação para detecção dos gêneros Enterococcus e Veillonella da microbiota intestinal humana
DOI:
https://doi.org/10.11606/issn.1679-9836.v104iesp.e-242581Palavras-chave:
Microbioma Gastrointestinal, Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real, Enterococcus, Veillonella, Desnaturação de Ácido NucleicoResumo
A microbiota intestinal humana é composta por cerca de 100 trilhões de organismos, como bactérias, vírus, protozoários e fungos, que vivem em simbiose com o hospedeiro. Esses microrganismos desempenham papel essencial na manutenção da homeostase intestinal e na prevenção de doenças. Entretanto, alterações em sua composição levam a um estado de desequilíbrio, a disbiose, que está associada a doenças inflamatórias intestinais e ao câncer colorretal. Entre os gêneros de interesse, Enterococcus spp. e Veillonella spp. apresentam funções distintas relacionada à regulação do pH intestinal, síntese de nutrientes e fermentação de lactato. O estudo teve como objetivo desenvolver um método baseado em PCR em tempo real (qPCR) para detecção qualitativa desses dois gêneros bacterianos na microbiota intestinal humana. Para isso, foram recuperadas 13 e 27 sequências gênicas de RNA ribossômico de Enterococcus e Veillonella, respectivamente, a partir do banco GenBank, utilizadas para criação de uma sequência consenso e desenho de pares de primers específicos. As reações foram conduzidas em termociclador Rotor-Gene Q-5Plex HRM, com temperatura de hibridação otimizada em 58 °C e 56 °C, e pico de dissociação determinado em 82,1 °C e 82 °C para Enterococcus e Veillonella, respectivamente. A metodologia demonstrou eficácia e especificidade na identificação dos microrganismos, validando o uso da qPCR como alternativa viável e de menor custo em relação às técnicas de sequenciamento para a análise taxonômica de bactérias intestinais.
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Referências
1. Sender R, Fuchs S, Milo R. Revised Estimates for the Number of Human and Bacteria Cells in the Body. PLoS Biol. 2016 Aug 19;14(8):e1002533. Doi: 10.1371/journal.pbio.1002533.
2. Quaglio AEV, Grillo TG, De Oliveira ECS, Di Stasi LC, Sassaki LY. Gut microbiota, inflammatory bowel disease and colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2022;28:4053-60.
3. Ben Braïek O, Smaoui S. Enterococci: Between Emerging Pathogens and Potential Probiotics. Biomed Res Int. 2019;5938210. Doi: 10.1155/2019/5938210.
4. Daca A, Jarzembowski T. From the Friend to the Foe-Enterococcus faecalis Diverse Impact on the Human Immune System. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2422. Doi: 10.3390/ijms25042422.
5. Wei Y, Palacios Araya D, Palmer KL. Enterococcus faecium: evolution, adaptation, pathogenesis and emerging therapeutics. Nature Rev Microbiol. 2024;22:705–21.
6. Krawczyk B, Wityk P, Gałęcka M, Michalik M. The many faces of enterococcus spp.—commensal, probiotic and opportunistic pathogen. Microorganisms. 2021;9.
7. Alok A, Kollu VS, Kalyatanda G. Veillonella Discitis: A Rare Presentation and Review of Literature. HCA Healthcare J Med. 2024;5(6).
8. Zhang SM, Huang SL. The Commensal Anaerobe Veillonella dispar Reprograms Its Lactate Metabolism and Short-Chain Fatty Acid Production during the Stationary Phase. Microbiol Spectr. 2023;11(2).
9. Franco Álvarez M, Jardi Cuadrado A, Fernández Cambeiro MF, Domínguez Lago A, Díaz Peromingo JA. Veillonella atypica bacteraemia: Case report and literature review. IDCases. 2025;40.
10. Yang Z, Wang J, Chen Y, Chen T, Shen Z, Wang Y, et al. Veillonella intestinal colonization promotes C. difficile infection in Crohn’s disease. Cell Host Microbe. 2025;33(9):1518-34.e10.
11. O’Riordan KJ, Moloney GM, Keane L, Clarke G, Cryan JF. The gut microbiota-immune-brain axis: Therapeutic implications. Cell Reports Medicine. Cell Press; 2025:6.
12. Rolando JC, Melkonian A V, Walt DR. The Present and Future Landscapes of Molecular Diagnostics. Ann Rev Analyt Chem [Internet]. 2025. Doi: https://doi.org/10.1146/annurev-anchem-061622-
13. Harshitha R, Arunraj DR. Real-time quantitative PCR: A tool for absolute and relative quantification. Biochem Mol Biol Educ. 2021;49(5):800-12.
14. Li F, Liu J, Maldonado-Gómez MX, Frese SA, Gänzle MG, Walter J. Highly accurate and sensitive absolute quantification of bacterial strains in human fecal samples. Microbiome. 2024;12(1).
15. Lo YMD, Chiu RWK, Chan KCA, Pryor RJ, Wittwer CT. Real-Time PCR and Melting Curve Analysis Real-Time Polymerase Chain Reaction and Melting Curve Analysis.
16. Shahrajabian MH, Sun W. The Significance and Importance of dPCR, qPCR, and SYBR Green PCR Kit in the Detection of Numerous Diseases. Curr Pharm Des. 2024;30(3):169-79.
17. Walter J, Ley R. The human gut microbiome: Ecology and recent evolutionary changes. Ann Rev Microbiol. 2011;65:411-29.
18. Tozzo P, Delicati A, Caenazzo L. Human microbiome and microbiota identification for preventing and controlling healthcare-associated infections: System Rev Front Public Health. 2022;10:989496. Doi: 10.3389/fpubh.2022.989496.
19. Deb P, Rakshit T. A comparative study of traditional and molecular methods for detecting bacterial infections in tertiary care hospitals. Int J Multidiscip Res (IJFMR) [Internet]. 2025;7(4). https://www.ijfmr.com/papers/2025/4/54059.pdf
20. Louie M, Louie L, Simor AE. The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases. CMAJ. 2000;163(3):301-9. Doi: 10.1016/s1381-1169(00)00220-x.
21. Bartoš O, Chmel M, Swierczková I. The overlooked evolutionary dynamics of 16S rRNA revises its role as the “gold standard” for bacterial species identification. Sci Rep. 2024;14(1).
22. Clarridge JE 3rd. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 2004;17(4):840-62. Doi: 10.1128/CMR.17.4.840-862.2004. PMID: 15489351; PMCID: PMC523561
13. Furet JP, Firmesse O, Gourmelon M, Bridonneau C, Tap J, Mondot S, et al. Comparative assessment of human and farm animal faecal microbiota using real-time quantitative PCR. FEMS Microbiol Ecol. 2009;68(3):351-62.
24. Tavares ER, Azevedo CS, Panagio LA, Pelisson M, Pinge-Filho P, Venancio EJ, et al. Accurate and sensitive real-time PCR assays using intergenic spacer 1 region to differentiate Cryptococcus gattii sensu lato and Cryptococcus neoformans sensu lato. Med. Mycol. 2016, 54, 89-96.
25. Otaguiri ES, Morguette AEB, Morey AT, Tavares ER, Kerbauy G, de Almeida Torres RSL,et al. Development of a melting-curve based multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of Streptococcus agalactiae and genes encoding resistance to macrolides and lincosamides. BMC Pregn. Childbirth 2018;18:126.
26. Van Bergen KJM, Stuitje AR, Akkers RC, Vermeer HJ, Castel R, Mank TG. Performance of a novel melting curve-based qPCR assay for malaria parasites in routine clinical practice in non-endemic setting. Malar. J. 2023;22:191.
27. Wan Z, Zhang Y, He Z, Liu J, Lan K, Hu Y, et al. A melting curve-based multiplex RT-qPCR assay for simultaneous detection of four Human Coronaviruses. Int. J. Mol. Sci. 2016;17:1880.
28. Tavares ER, de Lima TF, Bartolomeu-Goncalves G, de Castro IM, de Lima DG, Borges PHG, et al. Development of a melting-curve-based multiplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of viruses causing respiratory infection. Microorganisms 2023;11:2692.
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