Otimização da PCR em tempo real - Sybr Green para detecção do Herpes Vírus Humano tipo 6 (HHV-6)

Resumo

HHV-6 é o agente etiológico do Exantema Súbito e considerado a sexta doença mais comum na infância. Em indivíduos imunocomprometidos, a reativação da infecção latente pode causar doença aguda ou morte. Padronizamos PCR em Tempo Real utilizando a química Sybr Green na detecção do HHV-6 e comparamos os resultados com a PCR convencional. Um fragmento de 214 pb foi clonado através do kit pGEM-T do sistema Promega. Com este clone, foram feitas diluições seriadas em um pool de leucócitos negativos a partir de 10-6 ng/µL (equivalente a 2465,8 moleculas/µL) até 10-9 (equivalente a 2,46 moleculas/µL). As diluições foram amplificadas por PCR em Tempo Real utilizando Sybr Green, com primers HHV3 5' TTG TGC GGG TCC GTT CCC ATC ATA 3' e HHV4 5' TCG GGA TAG AAA AAC CTA ATC CCT 3' e pelo método convencional, PCR nested usando primers HHV1 (externo): 5' CAA TGC TTT TCT AGC CGC CTC TTC 3'; HHV2 (externo): 5' ACA TCT ATA ATT TTA GAC GAT CCC 3', HHV3 (interno) e HHV4 (interno): 5' TCG GGA TAG AAA AAC CTA ATC CCT 3'. O limite de detecção foi determinado pelas diluições seriadas do plasmídio contendo um fragmento de HHV6: para o ensaio com Sybr Green, foi de 24,6 moleculas/µL e para a PCR nested, 2,46 moleculas/µL. Elegemos o PCR em Tempo Real - Sybr Green como método diagnóstico e quantitativo do HHV-6 devido a sua boa sensibilidade e menor risco de contaminação.